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董梦秋實驗室为交联质谱技术再添利器

發布時間:2019/09/07

董梦秋實驗室与合作者近期在《Nature Communications》杂志上连续发表了两篇论文,不断提升基于质谱的蛋白质结构分析技术。文章的题目分别是 “Improving mass spectrometry analysis of protein structures with arginine-selective chemical cross-linkers” 和 “A high-speed search engine pLink 2 with systematic evaluation for proteome-scale identification of cross-linked peptides”。前者介绍了新型精氨酸特异性交联剂ArGO和精氨酸/赖氨酸双选择性交联剂KArGO的开发和应用,2019 年9月2日发表;后者介绍了快速精准的新一代交联鉴定软件pLink 2以及完整、客观的软件评测方案,2019 年7月30日发表。


董梦秋實驗室一直致力于开发和完善交联质谱技术(英文全称Chemical cross-linking of proteins coupled with mass spectrometry, 简称CXMS或XL-MS)。CXMS利用化学交联剂将蛋白质或蛋白质复合体中空间距离足够接近的两个氨基酸通过共价键连接起来,酶切成肽段后用质谱鉴定出交联位点,从而获取低分辨度结构信息,帮助推断蛋白质在三维空间的折叠状态以及蛋白-蛋白相互作用的大致区域。相比于晶体和冷冻电镜技术, CXMS对样品量和样品纯度要求低,可捕获蛋白质在溶液中的动态,并且具有简单、快速等优点。因此,CXMS在过去十年中得到了广泛应用,常常助力解析大型蛋白质复合体的精细结构,以及寻找蛋白与蛋白之间直接相互作用的区域。作为先行者和推动者,董梦秋實驗室与计算科学、有机化学和蛋白质科学等领域的研究团队长期密切合作,全方位发展交联质谱技术,包括开发软件 (Yang B, Nat Meth 2012; Lu S, Nat Meth 2015)、交联剂 (Tan D, eLife 2016; Zhang X, Anal Chem 2018)、新的方法流程和应用 (Lu S, Nat Meth 2015; Gong Z, Biophys Rep 2015; Ding YH, Anal Chem 2016; Ding YH, J Biol Chem 2017)。


當前交聯質譜技術的一個明顯局限是過分依賴氨基特異性的NHS酯交聯劑。此類交聯劑主要靶向賴氨酸,得到的結構信息有限,對于缺少賴氨酸的蛋白或蛋白區段,這個缺陷尤其明顯。因此,開發針對其他類型氨基酸的新型交聯劑成爲亟待解決的問題。


为了得到更丰富的结构信息,董梦秋實驗室与北京大学雷晓光實驗室合作开发了靶向精氨酸的交联剂。该系列交联剂在含有1-3个单体单元的聚乙二醇两端连接芳香基取代的乙二醛 (aromatic glyoxal),称为 ArGO1-3。ArGO可以共價連接兩個精氨酸的側鏈胍基,具有良好的選擇性,彌補了氨基交聯劑的不足,但在不同蛋白樣品上的表現參差不齊。爲了改善性能和增加使用範圍,作者將ArGO交聯劑的一端換成了靶向賴氨酸的鄰苯二甲醛,並將其命名爲KArGO。KArGO使蛋白質表面更多的氨基酸殘基成爲靶點,增加了結構覆蓋度,在多個標准蛋白樣品上均表現出穩定可靠的交聯效果。作者進一步將KArGO應用在CNGP和UtpA等蛋白複合物的結構鑒定中,結果表明KArGO彌補了已有賴氨酸交聯劑的不足,提供了豐富的互補結構信息。


图 1. KArGO 的化学式和交联反应


CXMS的另一个关键环节是质谱数据分析。现有的交联肽段鉴定软件多达几十种。相同数据用不同软件分析得到的结果不尽相同,甚至差异巨大,因此交联质谱领域迫切需要一套客观、实用的软件评测方案。在7月30号发表的pLink 2文章中,董梦秋實驗室协助中科院计算所贺思敏研究员领导的pFind团队建立了全面的评测体系,并对十种主流软件进行了评测和比较,其中包括2012年双方合作开发的pLink 1软件 (Yang B, Nat Meth 2012) 及其升级换代版pLink 2。pLink 2整合了pLink 1和蛋白质二硫键鉴定软件pLink-SS (Lu S, Nat Meth 2015) 的所有功能,从内核算法到图形界面都焕然一新。在模拟数据集、合成肽段数据集、15N标记数据集和陷阱库方法等四种系统性评测实验中,pLink 2和pLink 1的灵敏度和准确度都位居前两名,远超其他软件。以模拟数据集(谱图几近完美)测试结果为例,pLink 1 和 pLink 2在5%假发现率条件下的灵敏度和准确度分别达到和超过99.8%。pLink 2还有非常明显的速度优势;在变化交联形式、数据规模和蛋白序列库规模的20组评测中,pLink 2比pLink 1平均快40倍,比灵敏度和准确度位居第三的Kojak软件平均快3倍。从2018年元旦免费公开发布到文章发表的一年多时间里,pLink 2软件已经拥有1000多名用户。世界七大洲中,除南极洲外,都有pLink 2用户。


董梦秋實驗室2015级PTN博士生曹勇在两篇文章中都是共同第一作者。精氨酸特异性交联剂文章的共同第一作者还有雷晓光實驗室的英国籍博士后Alexander X. Jones以及博士生唐毓良,通讯作者是雷晓光博士和董梦秋博士,其他作者还有王建华、丁曰和、谭惠、陈镇霖、方润乾、尹吉澧、陈荣昌、朱星、佘杨、黄牛、邵峰、叶克穷和孙瑞祥。pLink 2文章的共同第一作者还有pFind团队的博士生陈镇霖和已经毕业的硕士生孟佳明,通讯作者是董梦秋和贺思敏博士,其他作者还有尹吉澧、方润乾、樊盛博、刘超、曾文峰、丁曰和、谭丹、邬龙、周文婧、迟浩、孙瑞祥。两项研究都得到了国家自然科学基金委、科技部、中科院和北京市政府的资助。